合西生物丨菌体裂解产物和代谢产物对人体皮肤胶原稳态的影响         

摘要：

在皮肤衰老过程中，胶原基质（ECM）蛋白质的产生，如Ⅰ型胶原减少，而降解ECM的基质金属蛋白酶（MMPs）的合成增加，导致体内失衡，产生皱纹。在本研究中，我们研究了三种双歧杆菌和五种乳酸菌的细菌裂解物和代谢物对人体真皮成纤维细胞在肿瘤坏死因子α（TNF-α）挑战下的胶原稳态的影响，该挑战模拟了破坏皮肤结构的炎症条件。根据成纤维细胞存活率和充实度、Ⅰ型前胶原的数量、MMP-1/Ⅰ型前胶原比率、细胞因子和生长因子等指标来衡量抗衰老性能。预期的是，TNF-α的挑战会增加MMP-1/Ⅰ型前胶原比率和促炎细胞因子的水平。在使用益生菌的情况下，不同的细菌种类、品系和形式的差异明显。通常来说，细菌裂解物对生物标志物的反应不太明显。在所有品系中，双歧杆菌动物乳杆菌品系Bl-04和B420在无挑战和挑战条件下最好地维持了Ⅰ型前胶原的产生和MMP-1/Ⅰ型胶原比率。由双歧杆菌产生的代谢物，而不是它们的裂解物，在挑战时减少了几种促炎细胞因子（IL-6、IL-8和TNF-α），而乳酸菌产生的代谢物则没有。这些结果表明，动物乳杆菌产生的代谢物，特别是Bl-04和B420品系的代谢物，可以支持皮肤中的胶原稳态。

引言：

皮肤衰老是一个复杂的过程，受内在和外在因素的综合影响。在真皮层，成纤维细胞分泌细胞外基质（ECM）成分，其中最重要的是Ⅰ型胶原。在老化皮肤中，老化细胞的增加可能阻碍合成胶原的能力。皮肤真皮层成纤维细胞数量减少、ECM蛋白质合成减少和蛋白质降解增加可能破坏结构完整性并导致皱纹形成。

肿瘤坏死因子α（TNF−α）是一种由免疫细胞和皮肤细胞释放的信号分子。它对细胞的影响因细胞而异，可以调节细胞周期和增殖，也可以诱导凋亡和坏死细胞死亡。在皮肤中，TNF−α抑制胶原合成，促进基质金属蛋白酶（MMPs）的产生，并上调其他促炎细胞因子，例如白细胞介素IL−6和IL−8，这可能加重炎症反应。TNF-α的过度表达由紫外线（UV）辐射和随年龄增加的细胞衰老所诱导。术语“炎症老化”用于描述慢性、低级别、基础性炎症的存在，这种炎症也发生在皮肤中，可以是由生活方式和环境因素引起的。长期存在的TNF-α会增加活性氧（ROS）水平，并导致人体真皮成纤维细胞的早衰，从而引发有害效应的循环。

2.材料和方法

2.1.HDF细胞培养

筛选实验使用的是从年轻成年人皮肤中分离得到的正常初级HDFs细胞（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。细胞在37°C、5% CO2、湿润的气氛中使用Medium106培养基培养，并添加低血清生长补充物（LSGS）和1%的抗生素-抗菌剂（所有细胞培养试剂均为Thermo Fisher Scientific产品），并按照制造商的说明进行细胞传代。实验在细胞6-8代进行。每个处理组进行五次重复测定细胞存活率和充实度，每个处理组进行三次重复的酶联免疫吸附实验。

2.2.细菌培养和样品制备

双歧杆菌动物酸乳杆菌菌株B420（DGCC420）、Bi-07（DGCC12895）和Bl-04（DGCC2908）在双歧杆菌58号培养基（DSMZ GmbH）中在37°C无氧条件下培养。Lactiplantibacillus plantarum LP12407（DGCC12407）和LP12418（DGCC12418）、Lacticaseibacillusparacasei Lpc-37（DGCC4981）、Lacticaseibacillusrhamnosus HN001（DGCC1460）和Ligilactobacillussalivarius Ls-33（DGCC9868）在Man,Rogosa和Sharpe（MRS）培养基（Neogen）中在37°C无氧条件下培养。这些细菌菌株来源于Danisco全球培养物集合（DGCC）。

细菌培养至指数生长期，并使用光密度计（BioPhotometer，德国汉堡Eppendorf）和流式细胞术（FACSCalibur，美国加利福尼亚州圣何塞Becton Dickinson）测量细菌细胞浓度。细菌裂解物和代谢物样品的制备。简而言之，细菌细胞和可溶性代谢物在4°C下以2216×g离心5分钟进行分离。细菌沉淀物用添加LSGS的Medium 106再悬浮，并使用Precellys 24牛顿珠磨机（法国圣昆坦－安－伊韦利内省BertinTechnologies）和VK01研磨套件（BertinTechnologies）以6800rpm的速度进行三个30秒的循环裂解，样品在循环之间冰上保存。通过光学显微镜确认细胞的裂解情况。经0.2µm滤过的细菌裂解物（利用Sartorius的0.2µm注射器过滤器）以10个细菌细胞对一个皮肤真皮成纤维细胞的比例稀释在添加补充Medium 106中。可溶性代谢物以1%（体积比）的含量在添加补充Medium 106之前经0.2µm滤过器过滤。

2.3.炎症挑战

HDFs细胞在添加了双歧杆菌裂解物或代谢物的补充Medium 106中，使用重组人TNF-α（Thermo Fisher Scientific）以20 ng/mL的浓度进行炎症挑战。

2.4.细胞存活率和充实度

细胞存活率通过MTT试验进行评估。简而言之，HDFs（1×104个细胞/孔）被培养在96孔板（Nunc™MicroWell™，Thermo Fischer Scientific）中；24小时后，加入0.1 mL的检测样品（细菌裂解物、代谢物和对照样品）并在孔板中孵育72小时。随后，HDFs细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行两次小心洗涤，并在37°C、5%CO2、湿润的气氛中继续培养3小时，在改良的Dulbecco改良鹰都培养基（DMEM）中，加入0.5 mg/mL的MTT（硫唑嗪蓝四唑，Sigma-Aldrich）溶液，之后用0.12 mL二甲基亚砜（Sigma-Aldrich）取代溶液。在轨道摇床上避光孵育5分钟后，将90 µL的裂解物转移到96孔板中，使用EnSight板读取器（Perkin Elmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）在570 nm波长下测量吸光度（减去700 nm波长的背景吸光度）。

充实度通过测定细胞覆盖孔底的面积来评估细胞形态相关方面。为了测量充实度，HDFs细胞按照上述方法进行培养和处理。在与检测样品孵育72小时并用PBS进行两次小心洗涤后，使用EnSight板读取器及其附属软件（Kaleido版本2.0.3058.126）进行亮场成像来确定充实度。

2.5.酶联免疫吸附实验（ELISA）

利用酶联免疫吸附实验（ELISA）评估各种分子的生物合成。简而言之，将4×104个HDFs细胞/孔培养在24孔板（Costar®，Corning，美国纽约州）中，在37°C、5% CO2、湿润的气氛中孵育72小时。随后，加入1 mL的检测样品，并继续孵育72小时。作为I型前胶原合成的阳性对照，使用浓度为1 ng/mL的人转化生长因子β1（TGF-β1）（Sigma-Aldrich），在补充Medium 106中稀释。孵育结束后，收集细胞培养液进行ELISA分析，细胞用温暖的PBS洗涤一次，并按照制造商的说明用CelLytic™ M试剂（Sigma-Aldrich）裂解。使用Pierce BCA Protein AssayKit（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的说明测量裂解物的蛋白质浓度。ELISA结果根据相应HDF裂解物的蛋白质浓度进行归一化处理。

2.5.1.测量I型前胶原和MMP-1

使用Pro-Collagen I α1试剂盒（R&D Systems，美国明尼阿波利斯）分析HDF培养上清液中的I型前胶原含量。MMP-1测量采用Total MMP-1试剂盒（R&D Systems），该试剂盒检测人体活性和前蛋白质酶的形式。两个试剂盒均按照制造商的说明使用。MMP-1水平相对于I型前胶原以MMP-1/I型前胶原比值表示。

2.5.2.测量细胞因子和生长因子浓度

采用多重酶联免疫吸附实验（Multiplex ELISA）分析IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α（SP-XHuman 6-Plex Array）、血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（FGFb）（SP-X Human 2-Plex Array）的浓度。采用单反应酶联免疫吸附实验（Singleplex assays）分析细胞培养上清液中角质细胞生长因子（KGF;Simoa® KGF Developer Kit）和TGF-β1（Simoa® TGFβ1 Developer Kit）的浓度。多重酶联免疫吸附实验（MultiplexELISA）和单反应酶联免疫吸附实验（Singleplex assays）的试剂盒均从Quanterix（美国马萨诸塞州比勒利卡）购买，并按照制造商的说明使用。

2.6.统计分析

尽管观察到连续成纤维细胞传代之间仅存在极小的系统性差异，但受细菌裂解物和代谢物诱导的生物标志物值仍然经过了归一化处理，以解决可能存在的传代效应。这是通过首先计算来自不同传代的对照的平均差异，然后从所有生物标志物数据中减去这个差异来实现的。传代效应的大小通过方差分析（ANOVA）中生物标志物方差的解释比例来估计，与化合物和挑战所能解释的方差量进行比较。

对于数据的主要成分进行计算，其中每个观测值由每个益生菌菌株、样品类型和挑战的生物标志物均值组合而成。数据标准化为均值为0，方差为1，以使每个生物标志物具有相同的权重。计算了生物标志物间的Spearman相关性，并使用渐近p值确定它们的统计显著性。

针对所有处理与相应对照的配对比较分别进行，对每个生物标志物进行分析（将裂解物样品和代谢物样品与相应的HDF传代对照进行比较）。对于无挑战数据，对照处理为培养基；对于所有生物标志物的挑战数据，对照处理为TNF-α；对于I型前胶原的差异，对照处理为TGF-β1。如果组间方差未通过Levene's检验显著差异，则采用标准t检验；如果组间方差存在显著差异，则采用Welch's t检验。对于由于缺失值导致无法进行比较的情况，得到的p值设为1，并包含在对多个同时检验的后续修正中。所有p值都经过Benjamini-Hochberg方法进行假发现率（FDR）校正。对于所有比较，p < 0.05被认为是统计显著的。效应大小以倍数变化报告，定义为被比较组的均值比率。所有分析均使用R软件进行，版本为4.2.2。

3.结果

通过测量不同传代之间数据的可变性，特别是对比测试样本（溶解的细菌细胞、代谢物和对照样本）和受挑战与未受挑战样本之间的差异，评估了细胞传代的影响。几乎在所有情况下，测试样本和挑战的效应明显超过传代效应数个数量级。唯一的例外是FGFb、IL-1β和TGF-β1，传代效应相对较高（分别为方差的9.2%，9.1%和8.3%），但小于测试样本和挑战的效应。

3.1.系统性炎症挑战的效应

在无挑战和TNF-α挑战的条件下，通过测量细菌细胞裂解物和细菌代谢物对HDF的影响，模拟了系统性炎症和外部压力因素（如紫外线辐射）的效应。为了区分所有数据中挑战的效应，我们进行了主成分分析（PCA）。

结果显示，前两个主成分解释了总变异的76.5%（图1），其中x轴上的第一个主成分解释了58.6%的变异，并将实验数据分为无挑战和TNF-α挑战样本。因此，TNF-α挑战对整个数据集的变异有很大影响。关于第二个主成分，解释了数据集中17.9%的变异，由于TNF-α挑战，挑战样本中的效应比无挑战样本更广泛；特别是代谢物样本更为广泛，双歧杆菌代谢物在第二个主成分的正侧，乳酸菌代谢物在负侧（图1）。

TNF-α挑战使HDF的生存能力增加到136%（未受挑战的HDF生存能力设为100%）。此外，TNF-α对HDF无细胞毒性，但足够强大以引起代谢变化。TNF-α挑战增加了细胞融合度、MMP-1/I型前胶原比值以及IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、KGF、TNF-α和VEGF的水平（表1），但降低了I型前胶原、FGFb和TGF-β1的水平。

图1. 实验数据集的主成分分析，展示了前两个主成分。无挑战样本以空心方框表示，挑战样本以实心方框表示。不同的颜色表示不同的样本类型：黑色-对照样本，红色-裂解物，蓝色-代谢物。

表1. 肿瘤坏死因子α（TNF-α）对人皮肤真皮成纤维细胞（HDF）生存能力、细胞融合度、前胶原、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、细胞因子和生长因子水平的影响，与未受挑战对照相比的变化。FGFb：纤维母细胞生长因子碱性形式，IL-10：白细胞介素10，IL-1α：白细胞介素1α，IL-1β：白细胞介素1β，IL-6：白细胞介素6，IL-8：白细胞介素8，KGF：角质细胞生长因子，TGF-β1：转化生长因子β1，VEGF：血管内皮生长因子。符号-表示与未受挑战对照相比的下降，符号+表示增加。

3.2. 菌株裂解物和代谢物对HDF生物标志物的影响差异
接下来，我们研究了裂解的益生菌及其产生的代谢物对HDF生存能力、细胞融合度、MMP-1/I型前胶原比值以及I型前胶原、细胞因子和生长因子水平的影响（图2）。

图2. 与相应的细胞传代对照相比，在未受挑战和TNF-α挑战的条件下，与细菌裂解物或代谢物处理的HDF中的参数相对折叠变化。对于无挑战的数据，对照是培养基；对于挑战数据，对照是TNF-α。TGF-β1被用作I型前胶原产生的阳性对照。与相应对照相比，在统计学意义上（p < 0.05），变化用粗体表示（折叠变化的详细p值可以在附录图1中找到）。在没有挑战的情况下，样本中没有可检测到的IL-1α或TNF-α；因此，效应大小没有包含在图中。

3.2.1. HDF生存能力和细胞融合度

细菌处理对细胞生存能力没有负面影响，HDF完全耐受这些处理，没有细胞毒性（图2）。四种细菌裂解物增加了未受挑战细胞的生存能力：Ls-33（1.3倍，p = 0.017）、LP12418（1.3倍，p = 0.031）、Bi-07（1.1倍，p = 0.023）和B420（1.4倍，p = 0.0027）；LP12407使受挑战HDF生存能力降低0.8倍（p =0.0089）。在没有挑战的情况下，没有任何代谢物对细胞生存能力产生显著影响；在挑战条件下，只有Bl-04代谢物改善了HDF的生存能力（与对照相比增加了1.4倍，p = 0.00019）。细胞融合度未受到任何裂解物的影响，而其中的代谢物只有Bl-04增加了细胞融合度（1.2倍，p = 0.0029），而TNF-α挑战细胞中HN001（0.8倍，p = 0.020）、LP12418（0.8倍，p =0.00077）、Lpc-37（0.9倍，p = 0.017）和Ls-33（0.8倍，p = 0.012）的细胞融合度下降。

3.2.2. I型前胶原和MMP-1/I型前胶原比值

在没有挑战的情况下，所有的裂解物和代谢物都增加了I型前胶原的水平，而在受到挑战的细胞中，Bi-07裂解物和代谢物以及LP12407、Lpc-37和Ls-33的裂解物没有影响前胶原的含量（图2）。用于I型前胶原产生的阳性对照TGF-β1相对未受挑战的对照组增加了1.8倍的I型前胶原（p = 0.016）。B. lactis B420和Bl-04的代谢物在无挑战和挑战条件下都导致了最显著的I型前胶原增加（超过3.7倍的折叠变化，其他的p值小于0.0001，与对照相比，除了挑战条件下Bl-04代谢物的p = 0.021）。相对于对照组水平，代谢物引起的增加尤为显著（图3）。B. lactis Bi-07的代谢物增加了未受挑战细胞中的前胶原水平（3.1倍，p = 0.00068），但在经过TNF-α挑战后的效应较为温和（1.4倍，p = 0.0099），与相应的对照相比较。

图3. 细菌裂解物和代谢物对比（a）无挑战和TNF-α挑战的HDF培养中的I型前胶原（b）MMP-1/I型前胶原比值的影响。

（a）值相对于对照组，归一化为100%。对照组的平均水平（无挑战的培养基对照和挑战的TNF-α对照，来自HDF传代的两个数据集）显示为黑色虚线，用于I型前胶原产生的TGF-β1阳性对照显示为红色虚线。柱状图显示均值±标准误差（SE），样本与对照组之间（样本与相应的HDF传代对照相比较）的统计显着性差异以星号表示，如下所示：p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。

在无挑战的条件下，B420、Bl-04和Bi-07的裂解物对前胶原有适度的影响（分别为1.5倍，p = 0.0021；1.5倍，p = 0.0014；1.5倍，p =0.0065）（图2），在挑战的细胞中也是如此（1.4倍，p < 0.0001；1.5倍，p= 0.0016；0.7倍，不显著）。不论挑战与否，没有任何裂解物或代谢物与对照相比降低了前胶原水平。在挑战条件下，TGF-β1对照使前胶原下调至TNF-α对照的60%（0.6倍，p = 0.011）（图3a）。在胶原的代谢平衡中，降解和产生之间的平衡至关重要；因此，我们确定了MMP-1与I型前胶原水平之比（图3b）。在无挑战的情况下，TGF-β1对照产生了更平衡的MMP-1/前胶原比值为0.9（相对于对照的0.3倍变化，p =0.0023），而培养基对照的比值为3.5。无挑战的TGF-β1对照比值为0.9被认为是这个实验的最佳值。在TNF-α挑战下，TNF-α对照生成的MMP-1/前胶原比值为12.4，与TGF-β1对照的11.6相比（没有统计学显著性差异）。

在未受挑战的条件下，Ls-33、Lpc-37、LP12407和Bi-07的裂解物和代谢物对MMP-1/I型前胶原比值产生的影响显著低于无挑战的培养基对照组（比值分别为1.2-2.0，p值为0.020-0.0090，相比之下，对照组比值为0.9-2.2，p值为0.031-0.0052）（图3b）。在TNF-α挑战条件下，与TNF-α对照组相比，B420（比值为8.0，p =0.00065）和Bl-04代谢物（比值为8.7，p = 0.0011）维持了最佳的MMP-1/I型前胶原比值。在挑战条件下，Lpc-37裂解物引起的MMP-1/I型前胶原比值最高（比值为25.1，p = 0.0013）。

3.2.3.细胞因子水平

益生菌裂解物和代谢物引起的细胞因子反应存在种属特异性和菌株特异性差异。总体而言，代谢物在未受挑战和TNF-α挑战的HDF中的影响较大（图2）。除了Bl-04外，几乎所有代谢物在未受挑战的HDF中都增加了IL-6和IL-8的水平；裂解物LP12407（0.7倍，p = 0.0053）和Ls-33（0.7倍，p = 0.0014）降低了IL-6水平。在TNF-α挑战的HDF中，IL-6的反应是混合的，B. lactis的代谢物相对于对照组下调（Bl-04：0.4倍，p < 0.0001；Bi-07：0.6倍，p = 0.026；B420：0.5倍，p < 0.0001），而一些乳酸菌则增加了它（LP12418：1.6倍，p =0.0024；HN001：1.3倍，p = 0.0027）。在裂解物方面，只有HN001在挑战的HDF中引起了IL-6的降低。在TNF-α挑战的HDF中，IL-8的反应各不相同，某些代谢物（Bl-04：0.8倍，p = 0.027）和裂解物（LP12407：0.8倍，p =0.029；Ls-33：0.7倍，p = 0.025）降低了IL-8水平，而LP12418的代谢物（1.7倍，p =0.0032）和HN001的代谢物（1.2倍，p = 0.033）使其增加。

IL-1β和IL-10的反应较小：在未受挑战的细胞中，IL-10仅在由Bi-07（倍数为6.1倍，p =0.048）、LP12407（倍数为4.2倍，p = 0.0031）和Lpc-37（倍数为3.0倍，p = 0.023）产生的代谢物中显著增加，而IL-β与Bl-04裂解物在TNF-α挑战的细胞中升高了2.0倍（p = 0.043）。在未受挑战的样本中，IL-1α无法检测到，在TNF-α挑战的细胞中没有任何处理对其产生影响。

TGF-β1和TNF-α的变化较小。在未受挑战的HDF中，B420和Bl-04的代谢物降低了TGF-β1水平（分别为0.8倍，p = 0.021和p =0.0047）；在TNF-α挑战的细胞中，这些代谢物以及Bi-07的代谢物都下调了TGF-β1（全部为0.7倍；p =0.0020，p = 0.0039和p = 0.045）。唯一增加TGF-β1的处理是LP12418的代谢物（1.3倍，p = 0.0048）。在TNF-α挑战的细胞中，TNF-α水平仅受到双歧杆菌代谢物B420（0.7倍，p = 0.0047）和Bl-04（0.6倍，p = 0.0022）的降低影响。唯一增加TNF-α水平的代谢物是LP12418（1.4倍，p = 0.0050）。

3.2.4.生长因子

与细胞因子一样，益生菌对生长因子的影响取决于处理形式，存在种属和菌株的差异。当HDFs用细菌裂解物处理时，生长因子在无挑战和挑战条件下通常不会产生反应。在TNF-α挑战的HDF中，Bi-07、LP12407和Ls-33的裂解物降低了VEGF的水平。在未受挑战的细胞中，唯一增加VEGF水平的裂解物是HN001，使其上调1.2倍（p = 0.034）。没有裂解物影响KGF在未受挑战的细胞中；在挑战的细胞中，只有LP12407的裂解物有影响，使其降低（0.7倍，p = 0.017）。

代谢物对生长因子的影响比裂解物更为显著。在未受挑战的细胞中，只有Bi-07的代谢物增加了FGFb的水平（1.7倍，p = 0.0027），而在TNF-α挑战的细胞中，LP12418的代谢物使其上调了1.7倍（p = 0.0030），而B420的代谢物使其降低了0.8倍（p = 0.029）。双歧杆菌B420和Bl-04的代谢物在未受挑战的细胞中使VEGF含量降低了0.6倍（分别为p = 0.0024和p= 0.0027），而在TNF-α挑战的细胞中，所有经过测试的双歧杆菌代谢物都显著降低了VEGF的水平（B420、Bi-07和Bl-04的比值都为0.3倍，分别为p< 0.0001，p = 0.00012和p =0.00014）。相反地，乳酸菌的代谢物增加了VEGF的水平，其中LP12418的增加最显著（1.7倍，p= 0.00023）。

在未受挑战的细胞中，代谢物对KGF的影响是不一致的，Bi-07（2.2倍，p = 0.024）、LP12407（2.0倍，p = 0.0084）和Lpc-37（1.7倍，p = 0.041）的代谢物增加了KGF的水平，而Bl-04的代谢物降低了KGF的水平（0.7倍，p = 0.044）。另一方面，在TNF-α挑战的HDF中，双歧杆菌的代谢物下调了KGF的水平（B420为0.7倍，p = 0.048；Bi-07为0.5倍，p =0.0037；Bl-04为0.7倍，p = 0.034），而LP12418的代谢物（1.9倍，p = 0.0024）和HN001的代谢物（1.5倍；p = 0.021）增加了KGF的水平。

4.讨论

胶原是皮肤中重要的结构蛋白，I型胶原主要由真皮成纤维细胞合成，占皮肤细胞蛋白比重85%至90%。随着年龄的增长，胶原的产生减少，降解增加，伴随着其他基质分子（包括多糖和蛋白多糖）如透明质酸的减少，弱化了结构支撑。胶原酶MMP-1降解纤维性胶原I型，但MMPs的功能仍然至关重要；在伤口愈合过程中，这些蛋白酶改变伤口基质，促进细胞迁移和组织重塑。皮肤的结构在合成和降解基质成分平衡时维持其稳态。在本研究中，我们通过研究益生菌裂解物和代谢物在TNF-α的细胞因子刺激下对HDFs的影响，在体外评估了可能支持胶原稳态的潜在益生菌候选物。

身体对突发的负面刺激以急性炎症反应做出回应。术语“炎症衰老”用于描述由生活方式或环境因素引起的慢性低度炎症。炎症衰老影响皮肤结构，导致胶原和弹性纤维的断裂和降解，减少新结构蛋白的产生，削弱屏障功能。30多岁时，人们的经过光照皮肤已经表现出各种炎症衰老的标志。UV-B辐射诱导角质形成细胞和真皮成纤维细胞中TNF-α的表达，进一步增加其他分子的分泌，包括促炎细胞因子和趋化因子。

TNF-α刺激真皮成纤维细胞增加MMP-1、促炎细胞因子IL-6和IL-8的产生，降解I型胶原并减少其合成。此外，长期存在的TNF-α会上调ROS水平并诱导人类真皮成纤维细胞的早期衰老。在无挑战的条件下，处理益生菌裂解物或代谢物后未检测到细胞外TNF-α（补充图 S4）。TNF-α挑战增加了MMP-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1α和-β、TNF-α、KGF和VEGF的产生，并下调了I型前胶原、FGFb和TGF-β1。此外，它抑制了TGF-β1对I型前胶原的合成（图2和图3a）。在与HDFs进行的单独研究中，15分钟的TNF-α挑战（浓度为20 ng/mL，与我们的研究相当）已经导致细胞内ROS增加1.5倍至2.5倍，并提高了几种丝裂原活化蛋白激酶和核因子kappa B的磷酸化水平。类似的效应也被观察到是由于UV-B挑战造成的。因此，我们认为我们的挑战足以模拟皮肤的炎症状态和ROS的形成，例如由紫外线辐射引起的，促进皮肤早衰。尽管72小时的TNF-α挑战没有导致细胞增殖的减少，但观察细胞转变为早衰状态是一个有趣的研究方向。

多项研究评估了HDFs在暴露于不同形式的细菌时对I型前胶原的产生和MMP-1的合成，以探索通过肠-皮肤轴的细菌抗衰老效应。例如，研究了灭活菌（Lactobacillus acidophilus KCCM12625P、Lactiplantibacillusplantarum HY7714、Lacticaseibacillus paracasei MCC1849和Lacticaseibacillus rhamnosus ATCC 7469）或细菌成分和代谢物（Latilactobacillus sakei KCCM 11175P 的脂质乳酸酸Lipoteichoicacid、L. plantarum HY7714的胞外多糖和Bifidobacteriumanimalis ssp. lactis MG741的细胞游离上清以及几种Lactobacillus、Streptococcus和Bifidobacterium菌株。UV辐射激活了多条信号通路，引起了对细菌形式对影响胶原合成和MMP产生的激酶的兴趣。

在我们的筛选中，所有的细菌裂解物和代谢物都增加了I型前胶原的水平，超过了仅含培养基的对照组，代谢物的水平甚至超过了TGF-β1阳性对照。B. lactis B420和Bl-04的代谢物在有无TNF-α挑战的情况下最明显地增加了I型前胶原的水平。然而，我们并未进一步研究胶原纤维或纤维形成。在这些代谢物挑战下，与I型前胶原相比，MMP-1的水平较低，表明具有有益的抗衰老作用。最近一项有关益生菌对皮肤光老化的系统回顾和荟萃分析，包括经过UV挑战的研究，总结了从两项小鼠和四项体外研究中得出的结果，即益生菌刺激（在原始出版物中以灭菌、热处理或发酵植物提取物形式测试）可下调MMP mRNA和蛋白水平。我们还研究了细菌裂解物和代谢物对胶原稳态的影响，基于HDFs的集落覆盖度以及几种细胞因子和生长因子的水平。

在我们的实验中，Bl-04的代谢物是唯一一个影响成纤维细胞集落成熟度，使其在TNF-α挑战时相对于对照组增加1.2倍，并提高了细胞存活率1.4倍（图2）。集落成熟度的增加表明成纤维细胞数量增加、扩展更广或更好地附着在底物上，或者其体积增加。Varani等人报道，在老年人（80岁以上）的皮肤真皮层细胞相对于年轻人（18-29岁）要较少扩展，表面积也较小。他们得出结论，在皮肤年龄增长时，成纤维细胞衰老和机械张力降低是导致胶原合成活性下降的重要因素，而在光损伤的皮肤中，由于细胞与断裂的胶原纤维接触导致张力丧失，最终导致胶原合成下降。Bl-04代谢物促进的HDFs的增殖、附着和扩展也可能是支持I型前胶原合成的因素。关于益生菌对HDF扩展、与胶原纤维接触和真皮机械张力的作用还需要进一步研究，但这需要不同的体外模型，即三维环境。在这个筛选数据集中，TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF和KGF的水平与彼此呈正相关，与I型前胶原呈负相关。在没有挑战的情况下，没有菌株或形式诱导HDFs产生TNF-α（。在TNF-α挑战下，细菌裂解物在TNF-α水平上与对照组无影响，只有B420和Bl-04的代谢物降低了TNF-α的水平；只有LP12418的代谢物增加了其水平。

除了刺激MMP-1的产生外，TNF-α还促进了IL-6和IL-8的释放，这反过来通过诱导c-Jun N-末端激酶（JNK）和激活蛋白-1（AP-1）进一步上调胶原降解蛋白酶的水平。虽然Bi-07的代谢物在没有挑战的情况下显著诱导了IL-6和IL-8（分别为397%和405%，相对于100%的对照），但它并没有增加MMP-1/I型前胶原比值，尽管Bi-07刺激的I型前胶原较B420和Bl-04代谢物较少，而这两者也未引起IL-6或IL-8的增加。在TNF-α挑战下，三种B.lactis菌株的代谢物在与对照组相比下调了0.4至0.6倍的IL-6，是唯一下调IL-6的代谢物样本。另外，只有Bl-04的代谢物在TNF-α挑战中降低了IL-8，在没有挑战的情况下也没有诱导IL-8的增加。

VEGF至少有六种亚型，我们使用的ELISA检测到的是在组织中常见的VEGF165亚型。我们注意到B. lactis的代谢物降低了VEGF、KGF和TGF-β1的水平，Bi-07的代谢物略微降低了FGFb的水平在挑战中。相反，所有的乳酸菌代谢物上调了VEGF，LP12418的代谢物在挑战中还增加了KGF和FGFb的水平。VEGF165和FGFb的表达在创伤愈合中会诱导血管新生。KGF在创伤愈合过程中由成纤维细胞产生，但它特异性地促进角质细胞形成新的上皮。在我们的研究中，B. lactis的代谢物在挑战下显著增加了I型前胶原的水平，因此，由于代谢物的缘故，VEGF、TGF-β1和FGFb的水平同时下降，这可能表明成纤维细胞减缓了这些生长因子的合成，这些生长因子也促进胶原合成。血管新生在炎症和慢性紫外线暴露中被刺激；虽然双歧杆菌的代谢物在挑战下下调了促炎细胞因子水平，VEGF的水平也降低，这可能意味着对慢性光损伤诱导的血管新生具有保护作用。LP12418的代谢物对其促伤口愈合的益处应该进行进一步研究，因为在挑战中，它增加了I型前胶原、FGFb、KGF、VEGF、TGF-β1、IL-6、IL-8和TNF-α的水平，这些在适当的伤口愈合中都至关重要。

益生菌具有种特异性和菌株特异性的差异，这些差异可以决定它们在特定用途上的适用性。某种乳酸菌或双歧杆菌菌株的遗传组成决定了益生菌在应对特定环境条件或压力因子时的功能机制，这可能在乳酸菌和双歧杆菌之间的不同结果中起到了重要作用。益生菌的作用方式包括定殖和正常化失调的肠道微生物群落、竞争性排除病原体和细菌素的产生、调节与胆汁盐代谢和致癌物和其他外源物的灭活相关的粪便酶活性、有机酸的产生、细胞粘附和粘膜产生以及免疫系统的调节，每种方式可能对某些菌株或物种独特。此外，应用方式会影响反应，这在本研究和我们之前的报告中通过双歧杆菌的代谢物和裂解物对表皮角质形成细胞、裂解物和益生菌衍生代谢物的影响已经显示出来。

一些乳酸菌和双歧杆菌分子可能对真皮产生影响。在我们的研究中，许多反应主要是由菌株分泌的代谢物或细胞外组分引起的（图2）。细菌产生的代谢物包括有机酸、短链脂肪酸和支链脂肪酸，以及分泌蛋白、吲哚、细胞外囊泡和细菌素。此外，细菌代谢物的组成可能因肠道和实验室培养条件中的营养物质和条件而异。

相反，裂解物包括益生菌的表面成分，如鞭毛、毛细菌、表面层蛋白质、胞囊多糖、脂质乳酸和脂多糖，以及细胞内成分。其中许多成分是微生物相关分子模式（MAMPs），它们与免疫细胞（如树突状细胞）相互作用，这可能解释了成纤维细胞缺乏反应的原因。成纤维细胞被认为是“非经典”先天免疫系统的一部分，例如在损伤修复期间与免疫细胞相互作用；在我们的研究中，成纤维细胞培养模型中没有免疫细胞。然而，我们注意到在不同的处理过程中细胞因子的产生存在差异，再次显示了种的特异性；双歧杆菌代谢物减少了TNF-α挑战中的IL-6，而某些乳酸菌的代谢物增加了它，正如观察到的IL-8一样。相比之下，裂解物对细胞因子水平几乎没有影响。

在我们的研究中，与对照组相比，细菌代谢物比细菌裂解物更多地增加了前胶原的产生。通过支持胶原稳态并减轻真皮成纤维细胞的炎症状态，Bl-04和B420是对皮肤抗衰老最有前景的菌株。最近的临床干预试验进一步研究了口服Bl-04对皮肤健康的影响。测量了3D成像，与安慰剂相比，Bl-04的摄入在第4周对几个皱纹参数产生了有益的效果。我们没有对裂解物或代谢物进行表征，但是比较B. lactis B420、Bi-07和Bl-04代谢物的组成可能揭示了介导Bl-04和B420代谢物有益效果的分子。B420、Bi-07和Bl-04品系在基因上相似，但彼此间存在小的基因组差异。

5.结论

我们筛选了八种益生菌菌株，以细菌的裂解物或代谢物作为研究对象，从而评估它们对存在或不存在TNF-α挑战的HDFs的抗衰老特性，以模拟炎症对皮肤结构的损伤。不同细菌物种和品系之间HDF的反应存在显著差异；总体而言，代谢物对测定参数的影响大于裂解物。体外筛选的结果表明，特别是Bl-04代谢物可以促进皮肤真皮成纤维细胞的增殖和密实度，平衡胶原稳态和在炎症应激期间免疫状态，这可能对皮肤结构具有有益的抗衰老作用。

本文献原文自 MDPI· 《Effects of Bacterial Lysates and Metabolites on Collagen Homeostasis in TNF-α-Challenged Human Dermal Fibroblasts》.